Het merendeel van de collectie in het Museo Antioquia werd geschonken door Fernando Botero, de wereldberoemde kunstenaar die werd geboren en opgroeide in Medellin. De Botero-galerij bestaat uit 12 afzonderlijke kamers waarin in totaal 118 kunstwerken worden getoond, waarvan sommige overeenkomen met internationale schilderijen uit de privécollectie van de kunstenaar.
Er zijn ook meer dan 500 kunstwerken die de creatieve activiteit van de regio en Colombia in de 19e en 20e eeuw weergeven. Inbegrepen in deze collectie zijn foto’s, schilderijen, tekeningen, cartoons en sculpturen. La Sala de las Tres Culturas (De kamer van drie culturen) onthult meer dan 200 objecten en zijn enkele van de beste voorbeelden van pre-Spaanse culturen, evenals picturale en sculpturale werken van religieuze kunst tijdens de koloniale periode. Ook wijdt het museum verschillende tijdelijke zalen aan artistieke, historische en wetenschappelijke werken, die zowel nationaal als internationaal van belang zijn.